Como es bien sabido, y se ha repetido infinidad de veces, el genoma del SARS-CoV-2 es uno de los de mayor tamaño entre los virus ARN (en torno al doble que la mayoría) debido a que suma cerca de 30.000 nucleótidos (29.9 kb).
Esta es una característica compartida con otros géneros (SARS-CoV-2 es un Betacoronavirus) y muchas especies de la familia Coronaviridae (tamaño en torno a 26-32 kb). No menos conocido es que su genoma lo conforman 14 marcos de lectura abierta (en adelante ORF, siglas de Open Reading Frame) que codifican 31 proteínas.
El ciclo celular del coronavirus en pocas palabras
Desde el punto de vista de su función, tras entrar el virus en la célula hospedadora, el ARN genómico comienza de inmediato su trabajo replicativo y de ensamblaje para generar nuevos viriones.
Siguiendo la dirección desde el cabo 5’ hasta la cola 3’ del genoma (Figura 1, arriba, rectángulo marrón), el ARN mensajero viral del SARS-CoV-2 contiene los dos primeros ORFs (ORF1a y ORF1b, también ORF1ab) que codifican la gran poliproteína 1a/b o pp1ab (Figura 1, izquierda, en medio, rectángulo verde). La pp1ab es escindida por proteólisis en 16 proteínas no estructurales (Nsp/Non-Structural Proteins) numeradas del 1 al 16 (Nsp1-Nsp10/Nsp12-Nsp16) (Figura 1, izquierda, abajo, rectángulos azules).
Las enzimas proteolíticas son dos: la proteasa papain-like/Pp-L (Nsp3) y la 3C-like o proteinasa principal o MP/Main Proteinase (Nsp5), respectivamente, aportadas por el propio virus. Por otra parte, el mismo segmento genómico codifica la Nsp12, que es la enzima polimerasa ARN-dependiente del ARN (RdRP) encargada de la replicación genómica.
En resumen (Figura 2), en cuanto al coronavirus pandémico vigente, el gran segmento genómico ORF1a/b que codifica la poliproteína 1ab y, tras su escisión enzimática, las Nsp, es fundamental para la transcripción y replicación viral, una vez que ha entrado en las células hospedadoras humanas o animales tras unirse al receptor ACE2 con la participación de otros correceptores (como la proteasa transmembrana dependiente de serina o TMPRSS2 y otros).
Las proteínas estructurales y el protagonismo de la espiga S
En el citoplasma de la célula invadida por el SARS-CoV-2, el ARN genómico de una sola cadena positiva (+ssARN) sirve de templado para la síntesis de una copia de ARN de sentido contrario. También se forman ARN subgenómicos (sgARNs), de menor tamaño, que codifican las cuatro proteínas estructurales: espiga (S/Spike), cubierta o envoltura (E/Envelope), membrana (M/Membrane o Matrix protein) y nucleocápside (N/Nucleocapsid) (Figura 1, derecha, rectángulos de color naranja).
Las proteínas estructurales son necesarias para el ensamblaje de las partículas víricas tras el proceso de transcripción-replicación intracitoplásmico y previo a la exocitosis.
Tras el proceso de traducción y replicación y con la participación del retículo endoplasmático y del aparato de Golgi, los diversos componentes genómicos y proteicos del virus son ensamblados y luego vehiculados por las vesículas de doble membrana, surgidas en la vía endosómica de producción de exosomas (nanovesículas de comunicación intercelular, de 50-100 nanómetros de tamaño que portan proteínas, lípidos y ácidos nucleicos de cadena corta, como los microRNAs).
Finalmente, son liberados (por exocitosis) al espacio extracelular. Desde aquí invaden nuevas células, a donde entran por diversos mecanismos, repitiendo el proceso.
En un trabajo previo destacábamos que la proteína S ha centrado de forma casi despótica durante los tres últimos años la atención de los científicos, de los medios de comunicación y del público. Sin duda, este hecho se debe a su protagonismo evolutivo, etiopatogénico, epidemiológico, vacunal y terapéutico. Porque la proteína S participa en primera línea en la evolución zoonótica, es necesaria su intervención para que ocurra el salto de especie (de murciélagos y/u otros animales a los humanos) y realiza la unión del coronavirus a la célula hospedadora (mediante la unión del RBD, o dominio de unión al receptor ACE2 de la membra celular), el primer paso para iniciar el ciclo intracelular.
Pero, además de su importancia evolutiva y patogénica, la espiga S es el lugar o diana inmunitaria donde se agolpan más mutaciones espontáneas (las variantes de preocupación y de interés, y sus interminables subvariantes, sobre todo las nuevas que conforman la multimutacional saga ómicron).
La proteína S también es el objetivo preferido de la mayor parte de los anticuerpos neutralizantes surgidos tras la infección natural (inmunidad natural), de los generados como respuesta a las diferentes vacunas (inmunidad vacunal) y de los mono y policlonales utilizados en terapéutica.
Por tanto, sobran los argumentos para asegurar que la proteína estructural S es la estrella más brillante del universo coronavírico. Pero en el universo no solo hay estrellas.
Un hecho de interés, que adelantamos en este apartado antes de tratar las proteínas accesorias, es que existen unos genes intercalados entre los diferentes estructurales (Figura 1, rectángulos de color violeta). Estos genes accesorios codifican las proteínas accesorias.
La denominación se debe a que ellos y sus productos de síntesis no son necesarios para la replicación en los cultivos celulares, lo cual no significa que carezcan de interés funcional o de valor biológico. El aristotélico Natura abhorret vacuum (Física, volumen 4) divulgado por François Rabelais en su Gargantúa (1534), puede parafrasearse aquí diciendo que la naturaleza aborrece el dispendio. Probablemente, todo sirve y tiene una función, aunque no conozcamos cuál es.
Las proteínas no estructurales (Nsp) y su implicación en la patogenia
En el citado artículo también resaltamos el creciente interés de los investigadores por el enorme segmento genómico ORF1a/b (en torno al 70% del genoma) que codifica las proteínas no estructurales (Nsp1-16).
Entre otras cosas, decíamos, por ejemplo, que una de las proteínas no estructurales la Nsp1, impide la unión del ARN celular al anclarse en el sitio de entrada (en la subunidad 40s del ribosoma). Inhibiendo la traducción, reduce el grupo de ribosomas y favorece la traducción del ARN viral, en detrimento del ARN celular.
Por otra parte, y en el contexto del SARS-CoV-2, Nsp1 es también el sitio diana del fármaco montelukast, un inhibidor del receptor de leucotrieno utilizado desde hace años para tratar el asma y ensayado en covid-19.
Otra Nsp, la proteína principal o 3C-like proteinasa (Nsp5) necesaria para la escisión enzimática de la poliproteína 1ab, es la diana terapéutica de nirmatrelvir. La Nsp9 hace lo propio con zotazafin (un inhibidor del factor eucariota eFI4a). En este sentido, aunque en relación con la NC cabe citar el fármaco español plitidepsina que interviene en la maquinaria traslacional del hospedador (proteína eEF1a).
Finalmente, la RdRP (Nsp12), de primordial trascendencia en el proceso de traslación-replicación, es el objetivo terapéutico de remdesivir y monulpiravir. Quizá no sobre decir que se han descrito mutaciones de resistencia al remdesivir mediante varios mecanismos.
Las menos famosas proteínas accesorias (ORF3-ORF10)
Las proteínas accesorias (PA) del SARS-CoV-2 son vecinas del extremo 3’ del genoma (Figura 1, derecha y abajo, color violeta) y menos conocidas. Se sabe desde hace años que cada especie viral dispone de su propia colección de PA lo que las hace únicas para cada especie vírica. Por ejemplo, SARS-CoV-1 dispone de ocho PA (ORF3a-9b) (Tabla 1) en tanto que otras especies virales del mundo animal solo tienen 3.
Las proteínas accesorias no participan en la replicación, pero tienen un claro potencial patogénico. En el caso de SARS-CoV-1, ORF6 antagoniza las vías de respuestas de interferón (INF).
En enero de 2020, cuando estaba comenzando la difusión mundial de la epidemia surgida en Wuhan (China) en noviembre-diciembre de 2019, y cuando un grupo de investigadores de Seúl (República de Corea) publicaron el primer mapa transcriptómico y epitranscriptómico de alta resolución del SARS-CoV-2, no se conocían todas las funciones de las proteínas accesorias. Sin embargo, en los últimos meses se ha ido ampliando su conocimiento. Una buena revisión aquí.
Hay pruebas firmes del papel esencial de las PA en relación con la respuesta inmune innata. Esto ocurre con las PA ORF3b, ORF7a y ORF6 las cuales antagonizan, por diferentes vías, la acción del interferón. Sin embargo ORF8 actúa como agonista del receptor de la interleucina 17 (IL-17).
Las proteínas accesorias implicadas en la patogenia viral y en la respuesta inmune del hospedador
Lo anteriormente expuesto es una somera introducción al comentario que sigue sobre un excelente artículo (PNAS, 30 de agosto de 2022) firmado por Marisa E. McGrath y colaboradores, de Baltimore y Rockville.
Los investigadores americanos analizan en profundidad el papel de las proteínas accesorias en la patogenia del SARS-CoV-2 y su implicación en la respuesta inmune del hospedador frente al coronavirus. Para semejante propósito, siguieron, en esencia, este esquema de trabajo:
Producción de clones infecciosos con deleciones. Crearon clones infecciosos del SARS-CoV-2 linaje WA-1 mediante el ensamblaje de fragmentos de ADN por genómica sintética basado en la Recombinación Asociada a la Transformación (TAR) en levadura (Saccharomyces cerevisiae) y Escherichia coli (Figura 4).
Producción de virus mutantes portadores de la espiga S de tres variantes en circulación (B.1.7.1, B.1.351 y P.1).
De un modo algo más ampliado, los investigadores hicieron lo siguiente:
Modificación de los fragmentos de ADN y estudio in vitro. Eliminaron (deleción) mediante CRISPR-Cas9 los genes ORF 3a/3b, 6, 7a/7b y 8 en la cepa prototipo SARS-CoV-2 (obtenida de un paciente real, el aislado USA/WA-1/2020 o WA-1) y realizaron el experimento in vitro en células Vero E6 incompetentes con INF-β y en las células A549-hACE2 competentes con INF-β.
Experimento en dos líneas de ratones. Posteriormente, hicieron lo propio (determinar el efecto de las deleciones accesorias) en un modelo murino utilizando ratones de las líneas BALB/c y K18-hACE2 de 12 semanas de edad, que fueron sacrificados los días 2 y 4 para el estudio de los pulmones (ambas líneas murinas) y el cerebro (solo los ratones K18-hACE2). Realizaron un análisis histopatológico (hematoxilina-eosina, puntuación de 0 a 5 para medir el grado de inflamación pulmonar), de concentración del virus y la extracción del ARN tisular.
Creación de las espigas mutantes sobre la variante Washington (WA-1). Crearon virus mutantes sobre el linaje WA-1, desarrollaron proteínas S recombinantes de las variantes B.1.1.7, B.1.351 y P.1 que reemplazaron la original de WA-1, a fin de caracterizar el impacto de las mutaciones accesorias naturales y de las mutaciones no espigas que se encuentran en las variantes en la patogenia del SARS-CoV-2.
Comparación entre las variantes virales. Compararon la aptitud replicativa in vitro de los virus recombinantes con la variante parental y caracterizaron las diferencias en la patogenia en el modelo murino.
Estudio de las citocinas/quimiocinas pulmonares. También determinaron el perfil de citocinas y quimiocinas inflamatorias pulmonares en los ratones y los genes participantes.
Resultados
Del análisis de los resultados extraemos algunos puntos de interés:
- Las proteínas accesorias ORF3a y ORF3b contribuyen significativamente a la replicación viral en el modelo animal murino. Los ratones infectados con el virus WA-1ΔORF3a/b (donde WA-1 es el virus Washington-1, el signo Δ significa deleción y ORF es el marco de lectura abierta), es decir, los ratones infectados con el virus portador de la deleción ORF3a/b demostraron una pérdida de peso atenuada y títulos pulmonares de virus significativamente reducidos, tanto en el día 2 como en el día 4 postinfección. El virus con la deleción ORF3a/b se atenuó en los ratones, un hecho respaldado por trabajos anteriores. Sin embargo, no ocurrió lo mismo con la deleción ORF6 (virus WA-1ΔORF6). Es decir, el virus con la deleción ORF3 es menos agresivo y causa menos daño general y pulmonar.
- En otras publicaciones previas, las deleciones ORF7a, ORF7b y ORF8 mostraron un título pulmonar significativamente reducido, pero McGrath y colaboradores no encontraron lo mismo, asumiendo que tal vez se debe a la diferente metodología empleada (por ejemplo, el uso de una menor dosis de inoculación). Pero encontraron diferencias significativas en la inflamación pulmonar provocada por el virus WA-1ΔORF8, es decir, portador de la deleción ORF8 (ver la postdata al final de esta colaboración).
- En cuanto a las citocinas y quimiocinas, los perfiles pulmonares de los ratones infectados con el virus WA-1ΔORF3a/b demostraron una expresión reducida de citocinas y quimiocinas inflamatorias, en comparación con el linaje original WA-1. La replicación atenuada de WA-1ΔORF3a/b resultó en la regulación a la baja de las citocinas y quimiocinas involucradas en el reclutamiento de neutrófilos, incluidas Ccl7, Csf3, Cxcl1, Cxcl3 y Cxcl5. Sin embargo, un pequeño subconjunto de genes estaba regulado al alza en los pulmones infectados con WA-1ΔORF3a/b. Dos de estos genes hiperexpresados son Il4 e Il5, los cuales impulsan la respuesta colaboradora T-helper 2 (Th2).
- ORF3a/b y ORF8 muestran funciones importantes en el comportamiento viral (patogenia) y en las respuestas del hospedador (inmunidad) frente al SARS-CoV-2. Las variantes B.1.351 y P.1 poseían mutaciones en ORF3a y todas las variantes estudiadas poseían mutaciones en ORF8.
Conclusión
Los autores sugieren que la aparición de las mutaciones en las proteínas accesorias de las variantes virales, particularmente ORF3a y ORF8, contribuyen a las diferencias patogénicas observada al comparar con la cepa original WA-1. Algunas mutaciones fuera de la espiga S pueden impulsar fenotipos críticos de infección y enfermedad por SARS-CoV-2. En este sentido, las mutaciones extraespiculares, como las accesorias, pueden tener un impacto en la enfermedad (fenotipos clínicos menos graves), tras la llegada de ómicron.
Según los investigadores, “El equilibrio de estas dos estrategias puede conferir cursos más prolongados de replicación y propagación del virus en los pulmones, al tiempo que permite un mayor tiempo para la transmisión del virus de una persona infectada a sus contactos”.
Dicho de otro modo, menos gravedad clínica (aguda), pero más capacidad (tiempo) de difusión en la población expuesta y no protegida.
Comentario
Por nuestra parte, respecto a lo que resta por conocer del SARS-CoV-2 y de sus parientes, nos afirmamos en lo dicho en Biotech Magazine & News en mayo de 2022 de que no solo de la espiga vive el coronavirus. Hay vida más allá de la espiga S.
En este sentido, las mutaciones accesorias pueden servir de ejemplo. Es obvio que aún tenemos mucho que aprender de este peculiar virus. Evidentemente, el fenómeno evolutivo y las consecuencias epidemiológicas y clínicas encajan en lo que está ocurriendo en el momento actual (final de octubre de 2022):
- Número de infecciones. Un nuevo incremento progresivo y discreto de casos. En algunas zonas, como Alemania, llamativo; en otras, se carece de información o no está disponible; e incremento de las hospitalizaciones en algunas zonas, pero no hay mayor mortalidad (comparado con las olas de las variantes Alfa y Delta).
- Mosaico genómico. Una enorme variabilidad genómica. Parece haberse olvidado el alfabeto griego para adoptar ahora una denominación coloquial y no oficial: sopa de variantes, enjambres y otras más (BQ.1, BQ.1.1, XBB, etcétera). La variabilidad genómica está originando descendientes (BQ.1.1.10, BA.4.6.3, XBB, CH.1.1) mucho más inmunoevasivas (Cao YR, et al, bioRxiv, 30 octubre 2022).
- Disparidad geográfica. BQ.1.1 creciendo en Alemania y Bélgica, XBB.1 creciendo en Singapur y Asia, comparadas con BA.5. En otros lugares, otras subvariantes.
- Vacunaciones o no vacunaciones. Muy diferentes grados de vacunación general y en mayores (no sólo en los países con bajo nivel de desarrollo, en torno al 34%) y de las segundas/terceras dosis de refuerzos (increíblemente, en algunos países muy desarrollados, como los Estados Unidos, sólo el 33%).
- Políticas sanitarias preventivas. Las variopintas políticas de medidas de prevención no farmacológica de aplicación absoluta (China), parcial y errática (muchos países) o nula.
- No olvidar que es una zoonosis. Todo ello sin pasar por alto que se trata de una zoonosis. En este sentido, el constante viaje evolutivo del virus por el mundo animal le permite adquirir nuevas mutaciones en la ya supermutada espiga S y en otras regiones genómicas (por ejemplo, en los genes accesorios), amén de las recombinaciones. Sirvan de modelo zoonótico los roedores, como los ratones silvestres, pero también las ratas domésticas infectadas desde los humanos que aman las mascotas (preprint, octubre 2022).
Postdata
Cuando este trabajo estaba preparado para su edición, nos topamos con un interesante artículo en línea algo posterior al comentado aquí. La investigación, publicada pre-print el 21 de octubre de 2022, la firman autores de Estados Unidos y de Europa entre los que figuran tres miembros de Pharmamar, la empresa farmacéutica española que comercializa Aplidin® (plitidepsina, inhibidor de la traducción).
Este interesante artículo se suma a otros que sostienen que los nuevos linajes y sublinajes virales (saga Ómicron), mediante mutaciones en sitios genómicos ajenos a la espiga S modifican la respuesta inmune innata y el perfil secretor de interleucinas traducidos en una evolución hacia formas clínicas menos agresivas, pero con mayor capacidad de difusión y contagio.
No se debe olvidar que, cuando ocurren muchos contagios (miles, millones), siempre habrá personas de alto riesgo en quienes la levedad no existe, amén de que cualquier infectado, incluso asintomáticos o paucisintomáticos, pueden desarrollar covid prolongado o secuelas post-covid (neurocognitivas, tromboembólicas).
Nadie sabe qué ocurrirá en el futuro con esta pesadilla, pero hay datos para pensar que los actuales o nuevos linajes herederos del virus zoonótico surgido para la historia en el mercado de Wuhan (China) seguirán cruzándose cada cierto tiempo con la humanidad en los años venideros, como hacen otros coronavirus respiratorios y, en menor medida, el MERS. Salvo que ocurriese el deseado supuesto de que el azar mutacional pusiera fin al susto vigente, como ocurrió con el SARS-CoV-1 de 2002-2003. Un deseo planetario.
