En la Universidad de Pekín, investigadores de diversas disciplinas han diseñado y desarrollado un diminuto microscopio de tres fotones, lo último en microscopía electrónica, de solo 2,17 gramos de peso, con el que han visualizado imágenes del cerebro profundo de roedores.
Este avance en microscopía multifotónica se explica en un estudio experimental que difunde Nature Methods, bajo la dirección de Cheng Heping, director del Centro Nacional de Imágenes Biomédicas de la Universidad de Pekín.
Estos neurocientíficos detallan las características del microscopio de tres fotones en miniatura (m3PM) de 2,17 gramos, con una configuración que -como dicen- maximiza la recolección de fluorescencia cuando se toman imágenes en regímenes de alta dispersión.
Han demostrado la capacidad de este ingenio al obtener imágenes de la actividad del calcio en toda la corteza y el hipocampo dorsal CA1, hasta 1,2 mm de profundidad, con una potencia de láser segura.
También permite la detección de actividades sensoriomotoras relacionadas con el comportamiento de las neuronas de la capa 6 en la corteza parietal posterior en ratones que se mueven libremente durante tareas de alcance de una sola bolita.
Concluyen que las imágenes potenciadas por m3PM permiten el estudio de los mecanismos neurales en la corteza profunda y las estructuras subcorticales, como el hipocampo dorsal y el cuerpo estriado dorsal.
Es bien sabido que el cerebro humano contiene miles de millones de neuronas y billones de sinapsis. El mapeo de su conectividad y dinámica funcional ha sido uno de los focos de la investigación global de este órgano, con dispositivos portátiles de imágenes microscópicas aplicables a pequeños animales como una de las herramientas de investigación.
Cerebro profundo en ratones
Ahora, el equipo de Heping ha logrado este ingenio después de trabajar durante años en su desarrollo. Así, diseñaron y desarrollaron su primer microscopio de dos fotones en miniatura con un peso de 2,2 gramos en 2017, con el que consiguieron imágenes dinámicas de actividades neuronales y sinápticas en el cerebro profundo de ratones durante el movimiento libre.
Después de cuatro años de desarrollo, un microscopio de dos fotones mejorado amplió el campo de imágenes en 7,8 veces y pudo capturar imágenes tridimensionales de las señales funcionales de las neuronas de la corteza cerebral.
El innovador microscopio de tres fotones presenta una mayor profundidad de imagen en comparación con anteriores microscopios en miniatura multifotónicos.
Consiguieron capturar imágenes de la actividad del calcio en una región del hipocampo de los cerebros de roedores, a una profundidad de hasta 1,2 milímetros, lo que supuso un gran desafío para los neurocientíficos de todo el mundo.
La actividad del calcio es un indicador que refleja la actividad celular de las neuronas y se puede monitorear cuando se combina con moléculas fluorescentes, un indicador de calcio. Sin embargo, la dispersión de la luz en el tejido cerebral, especialmente el callosum debajo de la corteza, da como resultado una distancia de penetración corta de la fluorescencia, lo que limita la profundidad de la imagen.
El hipocampo se encuentra debajo de la corteza y el callosum. “Con microscopios multifotónicos en miniatura anteriores no se había logrado capturar imágenes no invasivas”, explica Zhao Chunzhu, miembro del equipo.
Ahora, el microscopio de tres fotones logró con éxito la obtención de imágenes en el cerebro profundo de ratones que se movían libremente, gracias a una configuración óptica innovadora que maximizó la eficiencia de recolección de la dispersión de fluorescencia.
Excitación multifotónica
Los principios básicos de la excitación multifotónica se describieron por primera vez hace más de 70 años por la Nobel Maria Göppert-Mayer. Sin embargo, no pudo confirmarse hasta la invención de los láseres de rubí pulsados, casi 30 años después.
Con altas densidades de fotones, dos de ellos se pueden absorber simultáneamente (mediados por un estado virtual), al combinar sus energías para provocar la transición electrónica de un fluorocromo al estado excitado.
Dado que la energía de un fotón es inversamente proporcional a su longitud de onda, los dos fotones deben presentar longitudes de onda de casi el doble con respecto a aquellas requeridas para la excitación de un solo fotón.
Por ejemplo, si hay dos fotones que tienen una longitud de onda de 640 nanómetros (luz roja), estos pueden ser combinados para excitar un fluorocromo de absorción ultravioleta en la región (ultravioleta) de 320 nanómetros.
El resultado será una emisión de fluorescencia secundaria de longitudes de onda más largas (azul o verde). Esta aplicación única significa que las longitudes de onda más largas, extendidas hasta la región infrarroja, pueden usarse convenientemente para excitar los cromóforos en un solo evento cuántico, los cuales emitirán posteriormente radiación secundaria en longitudes de onda más bajas.
Excitación trifotónica
Por otra parte, la excitación de tres fotones o trifotónica es un evento de absorción óptica no lineal relacionada que puede ocurrir de manera similar a la excitación bifotónica.
La diferencia es que tres fotones deben interactuar simultáneamente con el fluorocromo para provocar una transición al estado de singlete excitado.
Un beneficio de la excitación trifotónica es que, para una absorción exitosa, se requiere solo una concentración de fotones 10 veces superior a la absorción bifotónica, lo que hace que esta técnica sea interesante para algunos experimentos.
La excitación trifotónica favorece la resolución del eje z en un grado aún mayor que la absorción de dos fotones. Esto se debe a una sección transversal más pequeña dedicada a la excitación del fluorocromo que resulta de la necesidad de una interacción simultánea entre tres fotones individuales.
En la práctica, un láser que emite luz infrarroja con una distribución de longitud de onda centrada en 1050 nanómetros es capaz de excitar un fluorocromo que absorbe fotones en la región ultravioleta (alrededor de 350 nanómetros: un tercio de la longitud de onda de excitación).
El mismo láser puede excitar simultáneamente otro fluorocromo a la mitad de la longitud de onda (525 nanómetros).
